如何選擇正確的西方墨點法 loading control

*** 什麼是 Loading control ***

在西方墨點法中都會偵測 loading control proteins 的表現,目的是證明每個 gel lane 中有平均load 相同量的蛋白質及實驗結果可以標準化 ( Standardize/Normalize ) 的依據.

 Loading control proteins的特點是在細胞中會大量表現且可證明Transfer實驗是否 Proteins完整轉移到膜上, 因此在發表文獻中若有運用西方墨點法時Loading control是絕對必須的.

功能:

1.       每個 gel lane 中有平均load 相同量的蛋白質.

2.       Transfer實驗 Proteins完整轉移到膜上.

3.       抗體雜交, 訊號偵測在不同 lanes中有一致性.

4.       實驗結果標準化 ( Standardize/Normalize ) 的依據.

*** 常用的 Loading control proteins  ***

*** β-actin ( 分子量: 43 kDa ) ***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       6種actin異構體 ( isoforms ) 之一.

3.       Actin 是一種存在所有真核細胞 ( 線蟲精子例外 ) 中球形蛋白質. 最高度保留 ( conserved ) 蛋白之一.

4.       功能: 參與肌肉收縮, 細胞移動及分裂, 胞器移動及維持細胞接合及形狀.

5.       不適用在骨骼肌細胞樣本 ( Skeletal muscle ) 當 loading control. ( 因為當細胞在生長狀態及和胞外基質作用時會改變 actin 的生成.

*** Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH, 分子量 36 kDa )***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       在大部分細胞及組織中穩定且持續高度表現.

3.       一種 Housekeeing gene .

4.       適用在 Western blot 及 RT-PCR 實驗中.

***  Tubulin ( 分子量: 55 kDa ) ***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       結構蛋白微管 ( Microtubules )的成分.

3.       高度保留 ( highly conserved ) 的蛋白質.

4.       α、β & γ tubulins 常被使用為 loading control.

*** Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 ( VDCA1/Porin ) ( 分子量: 31 kDa ) ***

1.       粒線體標誌 ( Mitochondrial marker ).

2.       beta barrel proteins

3.       位於粒線體外膜作用如孔洞可使分子擴散進出.

*** Cytochrome C oxidase ( COX IV , 分子量: 16 kDa ) ***

1.       粒線體標誌 ( Mitochondrial marker ).

2.       位於粒線體內膜,是電子傳遞鏈中最終酵素複合體.

3.       功能: 傳遞鏈中收集電子並與氧結合還原成水.

4.       持續性高度表現於粒線體,合適做粒線體標誌.

*** Lamin B1 *** ( 分子量: 66 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       核纖層( Nuclear lamina ) 中結構成分, 支持核膜( Nuclear envelop ) 並與細胞周期 ( Cell cycle ) 中核膜分解及再成形有關.

3.       Lamin B1在各物種間具有保留 ( Conserved ) 特性.

4.       在没有核膜的樣本中不適合做 loading control.

*** TATA binding protein ( TBP, 分子量: 38 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       一種專一性鍵結到 TATA box DNA序列的轉錄因子 ( Transcription factor ).

3.       高度保留於各物種間.

4.       在没有核膜的樣本中不適合做 loading control.

*** Proliferating cell nuclear antigen ( PCNA , 分子量: 29 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       DNA polymerase delta 的輔因子 ( Cofactor ).

3.       在細胞周期中DNA合成時會表現, 與真核DNA複製有關

4.       在不增生或處理抑制增生的細胞樣本中,不適合做 Loading control.

*** Histone H3 ( 分子量: 17 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker ).

2.       功能: 參與轉錄調節, DNA 修復及複製, 維持染色體穩定.

*** Vinculin ( 分子量: 117 kDa ) ***

1.       高分子量蛋白質標誌.

2.       一種細胞與細胞基質間結合的細胞骨骼蛋白 ( Cytoskeltal protein ).