超級好用的 Blocking reagent *** 安佳脫脂奶粉 ***

西方墨點法( Western blotting )中關於 Blocking的相關知識 

5% Non-fat milk in PBS-T bufffer 的功能:

1.       西方墨點法 ( Western blotting ) 中blocking reagent.

2.       預防抗體非專一性鍵結 ( non-specific binding ).

Antibody non-specific binding:

牛奶中富含蛋白質,因此在蛋白質轉移到 PVDF或Nitrocellulose 膜後,進行blocking,牛奶中蛋白質會鍵結在没有protein bands的位置例如在每條lane或每個protein band之間,之後在進行一級抗體的雜交作用,抗體就不會黏到没有protein bands 的位置,造成高背景 ( High background ).

西方墨點法中避免使用牛奶的原因:

1.       當使用 anti-goat 二級抗體: 牛奶內含牛 IgG, 因此anti-goat 二級抗體可能辨認牛 IgG, 造成高背景.

2.       當偵測磷酸化蛋白質: 牛奶內含磷酸化蛋白質, 可能造成干擾導致訊號低及高背景.

3.       當使用 Streptavidin-biotin 偵測系統: 牛奶內含內生性Biotin, Streptavidin 會偵測 biotin導致高背景.

常用的blocking reagents:

1.       Skim milk powder ( 脫脂奶粉 )

最便宜最容易取得的 blocking reagent, 超巿就買的到.一般使用濃度為 2.5-5%, 缺點是成分複雜易有高背景

2.       Bovine serum albumin ( BSA )

牛血清中純化出的白蛋白( Albumin ), 也是常用的 blocking reagent, 一般使用濃度為 2.5-5%. BSA 合適運用偵測磷酸化蛋白質表現的研究,缺點是價格昂貴.

3.       Fish gelatin

由冷水魚( Cold-water fish )的皮膚純化出 gelatin ( G7765 , Sigma ) , 一般可用於細胞培養盤的coating增加細胞附著或當 blocking reagent, 使用濃度為 0.1-5% 之間.不像BSA 或牛奶, fish gelatin 並不含任何血清蛋白質 ( Serum proteins )所以可以減少背景干擾. 缺點由於含內生性biotin所以不能使用在 biotin偵測系統. 

4.       Normal serum ( 如 fetal calf serum, goat serum )

由於全血清富含蛋白質,因此也可當 blocking reagent. 使用濃度較高為5-10%, 缺點為昂貴因此比奶粉或BSA較不普遍使用.全血清如BSA,均含免疫球蛋白 ( immunoglobulins )及血清蛋白, 可能與哺乳類抗體作用.

5.       Casein ( 酪蛋白 )

其實酪蛋白只是由牛奶中純化出的一種蛋白質, 但酪蛋白是磷酸蛋白,因此不適合在偵測磷酸蛋白質 ( Phosphoproteins )時使用.

6.       廠商提供的 blocking reagents:

通常含有專利保護的純化蛋白質, 不含磷酸蛋白, 免疫球蛋白,白蛋白或生物素( Biotin ). 缺點是價格昂貴且使用方式需廠商提供,各家不同;優點是快速,可以縮短實驗時間.

7.       Polyvinylpyrrolidone ( PVP )

一種非蛋白質blockingreagent的取代物. PVP 是水溶性polymer, 可以快速鍵結到 PVDF 或 NC 膜上, 使用濃度為0.5-2%, 時常與其它blcoking reagents混合如 casein. PVP 特別有益於偵測小分子蛋白.

推薦使用 blocking reagent:

       當然是脫脂奶粉,泡一大杯用不完倒掉也不覺得可惜,偵測磷酸蛋白質如 Akt, JNK,ERK等等,其實使用脫脂奶粉也做的出來, 先試看看,不行再換BSA即可.