打進體內間質幹細胞的命運.

標題:

           The Life and Fate of Mesenchymal Stem Cells

作者:   Elke Eggenhofer,¹ Franka Luk,² Marc H. Dahlke,¹ and Martin J. Hoogduijn.

期刊:  Front Immunol. 2014; 5: 148.

doi:  10.3389/fimmu.2014.00148

Abstract

       Mesenchymal stem cells (MSC) are present throughout the body and are thought to play a role in tissue regeneration and control of inflammation. MSC can be easily expanded in vitro and their potential as a therapeutic option for degenerative and inflammatory disease is therefore intensively investigated. Whilst it was initially thought that MSC would replace dysfunctional cells and migrate to sites of injury to interact with inflammatory cells, experimental evidence indicates that the majority of administered MSC get trapped in capillary networks and have a short life span. In this review, we discuss current knowledge on the migratory properties of endogenous and exogenous MSC and confer on how culture-induced modifications of MSC may affect these properties. Finally, we will discuss how, despite their limited survival, administered MSC can bring about their therapeutic effects.

重點1:

          間質幹細胞可以表現很多趨化素受器 ( Chemokine receptors ), 使得幹細胞可以專一性移動到損傷目標區.

重點2:

       自體( Endogenous ) 間質幹細胞在體內的移動方式目前是有爭議的.而經由血液流動的方式證據薄弱. 間質幹細胞確實存在各組織中且可能在組織內移動至受傷或發炎部位.

重點3:

         在體外培養的間質幹細胞當運用在治療注射後存活率不高, 靜脈注射間質幹細胞的方式會聚集在肺部且在24小時內會消失.活的間質幹細胞在其它組織是偵測不到.

重點4:

         體外培養間質幹細胞的培養條件如培養液及塑膠培養盤的貼附性對於細胞的表型 ( Phenotype )有很大的影響.在細胞培養環境中間質幹細胞的大小會增加及貼附分子會大量表現,這會影響間質幹細胞注射後的分佈.

重點5:

         間質幹細胞在注射後幾小時內會誘發系統性發炎反應而發炎現象可以在肺組織中偵測到.

重點6:

          靜脈注射體外培養的間質幹細胞可以藉由細胞分泌液 ( Secretome )調節宿主自體間質幹細胞及巨噬細胞的功能,進一步誘導組織再生及活化調節型 T 細胞,另方面也可觸發免疫抑制的反應.

間葉幹細胞對於腫瘤的治療有效嗎?

標題:

      The role of mesenchymal stem cells in cancer development.

作者: Hiroshi Yagi^* and Yuko Kitagawa

·         Department of Surgery, School of Medicine, Keio University, Tokyo, Japan

·         出版期刊:  Frontiers in Genetics. ,4,p261.

·         出版年:  2013.

·         Doi: 10.3389/fgene.2013.00261

摘要:

The role of mesenchymal stem cells (MSCs) in cancer development is still controversial. MSCs may promote tumor progression through immune modulation, but other tumor suppressive effects of MSCs have also beendescribed. The discrepancy between these results may arise from issues related to different tissue sources, individual donor variability, and injection timing of MSCs. The expression of critical receptors such as Toll-like receptor is variable a teach time point of treatment, which may also determine the effects of MSCs on tumor progression. However, factors released from malignant cells, as well as surrounding tissues and the vasculature, are still regarded as a “black box. ” Thus, it is still difficult to clarify the specific role of MSCs in cancer development. Whether MSCs support or suppress tumor progression is currently unclear, but it is clear that systemically administered MSCs can be recruited and migrate toward tumors. These findings are important because they can be used as a basis for initiating studies to explore the incorporation of engineered MSCs as novel anti-tumor carriers, for the development of tumor-targeted therapies.

譯文:

      間葉幹細胞 ( MSCs ) 對於癌症發展目前仍有爭議. 間葉幹細胞可能會透過免疫調節方式促進或抑制腫瘤的進展.文獻報告的不一致可能的原因有不同組織來源,捐贈者個體的變異及注射間葉幹細胞的時間點.有些重要受器( Receptors )的表現如 Toll-like 受器在治療的時間點上是有變異的,亦會決定間葉幹細胞對腫瘤的影響.然而,從腫瘤細胞及周遭組織及血管所釋放出的物質仍然是個謎.因此很難去釐清間葉幹細胞在癌症發育的專一角色.

      間葉幹細胞是促進或是抑制腫瘤發展目前仍然不清楚,但是清楚的是有系統地注射的間葉幹細胞會聚集及移動到腫瘤處.這些發現相當重要因為間葉幹細胞可做為未來新奇抗腫瘤攜帶者的角色及腫瘤標靶治療的基礎.

如何選擇正確的西方墨點法 loading control

*** 什麼是 Loading control ***

在西方墨點法中都會偵測 loading control proteins 的表現,目的是證明每個 gel lane 中有平均load 相同量的蛋白質及實驗結果可以標準化 ( Standardize/Normalize ) 的依據.

 Loading control proteins的特點是在細胞中會大量表現且可證明Transfer實驗是否 Proteins完整轉移到膜上, 因此在發表文獻中若有運用西方墨點法時Loading control是絕對必須的.

功能:

1.       每個 gel lane 中有平均load 相同量的蛋白質.

2.       Transfer實驗 Proteins完整轉移到膜上.

3.       抗體雜交, 訊號偵測在不同 lanes中有一致性.

4.       實驗結果標準化 ( Standardize/Normalize ) 的依據.

*** 常用的 Loading control proteins  ***

*** β-actin ( 分子量: 43 kDa ) ***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       6種actin異構體 ( isoforms ) 之一.

3.       Actin 是一種存在所有真核細胞 ( 線蟲精子例外 ) 中球形蛋白質. 最高度保留 ( conserved ) 蛋白之一.

4.       功能: 參與肌肉收縮, 細胞移動及分裂, 胞器移動及維持細胞接合及形狀.

5.       不適用在骨骼肌細胞樣本 ( Skeletal muscle ) 當 loading control. ( 因為當細胞在生長狀態及和胞外基質作用時會改變 actin 的生成.

*** Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH, 分子量 36 kDa )***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       在大部分細胞及組織中穩定且持續高度表現.

3.       一種 Housekeeing gene .

4.       適用在 Western blot 及 RT-PCR 實驗中.

***  Tubulin ( 分子量: 55 kDa ) ***

1.       細胞質標誌 ( Cytoplasmic marker ).

2.       結構蛋白微管 ( Microtubules )的成分.

3.       高度保留 ( highly conserved ) 的蛋白質.

4.       α、β & γ tubulins 常被使用為 loading control.

*** Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 ( VDCA1/Porin ) ( 分子量: 31 kDa ) ***

1.       粒線體標誌 ( Mitochondrial marker ).

2.       beta barrel proteins

3.       位於粒線體外膜作用如孔洞可使分子擴散進出.

*** Cytochrome C oxidase ( COX IV , 分子量: 16 kDa ) ***

1.       粒線體標誌 ( Mitochondrial marker ).

2.       位於粒線體內膜,是電子傳遞鏈中最終酵素複合體.

3.       功能: 傳遞鏈中收集電子並與氧結合還原成水.

4.       持續性高度表現於粒線體,合適做粒線體標誌.

*** Lamin B1 *** ( 分子量: 66 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       核纖層( Nuclear lamina ) 中結構成分, 支持核膜( Nuclear envelop ) 並與細胞周期 ( Cell cycle ) 中核膜分解及再成形有關.

3.       Lamin B1在各物種間具有保留 ( Conserved ) 特性.

4.       在没有核膜的樣本中不適合做 loading control.

*** TATA binding protein ( TBP, 分子量: 38 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       一種專一性鍵結到 TATA box DNA序列的轉錄因子 ( Transcription factor ).

3.       高度保留於各物種間.

4.       在没有核膜的樣本中不適合做 loading control.

*** Proliferating cell nuclear antigen ( PCNA , 分子量: 29 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker )

2.       DNA polymerase delta 的輔因子 ( Cofactor ).

3.       在細胞周期中DNA合成時會表現, 與真核DNA複製有關

4.       在不增生或處理抑制增生的細胞樣本中,不適合做 Loading control.

*** Histone H3 ( 分子量: 17 kDa ) ***

1.       核蛋白標誌 ( Nuclear marker ).

2.       功能: 參與轉錄調節, DNA 修復及複製, 維持染色體穩定.

*** Vinculin ( 分子量: 117 kDa ) ***

1.       高分子量蛋白質標誌.

2.       一種細胞與細胞基質間結合的細胞骨骼蛋白 ( Cytoskeltal protein ).

超級好用的 Blocking reagent *** 安佳脫脂奶粉 ***

西方墨點法( Western blotting )中關於 Blocking的相關知識 

5% Non-fat milk in PBS-T bufffer 的功能:

1.       西方墨點法 ( Western blotting ) 中blocking reagent.

2.       預防抗體非專一性鍵結 ( non-specific binding ).

Antibody non-specific binding:

牛奶中富含蛋白質,因此在蛋白質轉移到 PVDF或Nitrocellulose 膜後,進行blocking,牛奶中蛋白質會鍵結在没有protein bands的位置例如在每條lane或每個protein band之間,之後在進行一級抗體的雜交作用,抗體就不會黏到没有protein bands 的位置,造成高背景 ( High background ).

西方墨點法中避免使用牛奶的原因:

1.       當使用 anti-goat 二級抗體: 牛奶內含牛 IgG, 因此anti-goat 二級抗體可能辨認牛 IgG, 造成高背景.

2.       當偵測磷酸化蛋白質: 牛奶內含磷酸化蛋白質, 可能造成干擾導致訊號低及高背景.

3.       當使用 Streptavidin-biotin 偵測系統: 牛奶內含內生性Biotin, Streptavidin 會偵測 biotin導致高背景.

常用的blocking reagents:

1.       Skim milk powder ( 脫脂奶粉 )

最便宜最容易取得的 blocking reagent, 超巿就買的到.一般使用濃度為 2.5-5%, 缺點是成分複雜易有高背景

2.       Bovine serum albumin ( BSA )

牛血清中純化出的白蛋白( Albumin ), 也是常用的 blocking reagent, 一般使用濃度為 2.5-5%. BSA 合適運用偵測磷酸化蛋白質表現的研究,缺點是價格昂貴.

3.       Fish gelatin

由冷水魚( Cold-water fish )的皮膚純化出 gelatin ( G7765 , Sigma ) , 一般可用於細胞培養盤的coating增加細胞附著或當 blocking reagent, 使用濃度為 0.1-5% 之間.不像BSA 或牛奶, fish gelatin 並不含任何血清蛋白質 ( Serum proteins )所以可以減少背景干擾. 缺點由於含內生性biotin所以不能使用在 biotin偵測系統. 

4.       Normal serum ( 如 fetal calf serum, goat serum )

由於全血清富含蛋白質,因此也可當 blocking reagent. 使用濃度較高為5-10%, 缺點為昂貴因此比奶粉或BSA較不普遍使用.全血清如BSA,均含免疫球蛋白 ( immunoglobulins )及血清蛋白, 可能與哺乳類抗體作用.

5.       Casein ( 酪蛋白 )

其實酪蛋白只是由牛奶中純化出的一種蛋白質, 但酪蛋白是磷酸蛋白,因此不適合在偵測磷酸蛋白質 ( Phosphoproteins )時使用.

6.       廠商提供的 blocking reagents:

通常含有專利保護的純化蛋白質, 不含磷酸蛋白, 免疫球蛋白,白蛋白或生物素( Biotin ). 缺點是價格昂貴且使用方式需廠商提供,各家不同;優點是快速,可以縮短實驗時間.

7.       Polyvinylpyrrolidone ( PVP )

一種非蛋白質blockingreagent的取代物. PVP 是水溶性polymer, 可以快速鍵結到 PVDF 或 NC 膜上, 使用濃度為0.5-2%, 時常與其它blcoking reagents混合如 casein. PVP 特別有益於偵測小分子蛋白.

推薦使用 blocking reagent:

       當然是脫脂奶粉,泡一大杯用不完倒掉也不覺得可惜,偵測磷酸蛋白質如 Akt, JNK,ERK等等,其實使用脫脂奶粉也做的出來, 先試看看,不行再換BSA即可.